一、背景

小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞是從3T3細胞（Swissalbino）中經克隆分離得到的連續傳代的亞系。該細胞從快速分裂到匯合和接觸性抑制狀態經歷了前脂肪細胞到脂肪樣細胞的轉變。該細胞鼠痘病毒陰性；可產生甘油三酯，高濃度血清可增強細胞內脂肪堆積。

二、小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞培養步驟

1）復蘇小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中），培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞，傳代可參考以下方法：

1、棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞1-2次。

2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加5ml以上含10%血清的*培養基終止消化。

3、輕輕吹打小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞，脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4、按5-6ml/瓶補加培養液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養液的新皿中或者瓶中。

3）小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，進行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。

三、應用

小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞可以用于KRAS對3T3-L1、C2C12細胞增殖、自噬和成脂分化的影響：

研究使用si RNA敲降Kras的表達水平,探究其對3T3-L1和C2C12細胞增殖、自噬、成脂分化和脂質蓄積的影響及作用機制。首先,為探究KRAS對3T3-L1和C2C12細胞增殖能力的影響,本研究利用si-KRAS抑制KRAS表達后,通過Ed U和CCK-8方法檢測增殖變化;通過q RT-PCR檢測細胞增殖相關基因Mtor、Pcna和Myc的m RNA表達水平的變化。

結果表明,敲降KRAS后,3T3-L1和C2C12細胞增殖比例(分別為對照組的0.89±0.07、0.90±0.05倍)以及CCK-8細胞增殖活力均顯著下降(分別為對照組的0.82±0.02倍和0.80±0.02倍);增殖相關基因Mtor、Pcna和Myc的m RNA表達水平也顯著下降。

隨后,探討了KRAS對細胞自噬的影響。在抑制KRAS表達后,通過免疫熒光染色檢測細胞質內LC3B的表達變化;通過Western blot檢測細胞自噬關鍵蛋白LC3B-II/LC3B-I的表達變化;通過q RT-PCR檢測自噬相關基因Beclin 1和Atg7的m RNA表達變化。

相關結果表明,敲降KRAS后,3T3-L1和C2C12細胞內LC3B的熒光強度(分別為對照組的1.78±0.11倍和1.38±0.04倍)及LC3B-II/LC3B-I的水平顯著增加(分別為對照組的2.25±0.06倍和1.84±0.14倍),并且,Beclin 1和Atg7的m RNA水平也顯著上升。最后,我們探討了KRAS對3T3-L1和C2C12細胞成脂分化的影響及作用機制。

在敲降KRAS后,本研究通過油紅O(ORO)染色、甘油三酯水平檢測以及成脂相關基因Dgat1、Scd1、C/ebpβ和Hmgr的m RNA表達水平檢測明確了KRAS對成脂分化和脂質蓄積的影響;通過Western Blot方法檢測了MAPKs(ERKs、JNKs和p38)、PI3K磷酸化水平的變化;通過分別添加MAPK和PI3K通路的激活劑ANI和740 Y-P,探究KRAS對3T3-L1和C2C12細胞成脂的潛在作用機制。

結果表明,抑制KRAS表達后,細胞內甘油三酯水平(分別為對照組的1.24±0.02倍、1.24±0.01倍)、ORO OD520值以及Dgat1、Scd1和C/ebpβm RNA表達水平顯著增加,ERK1/2、JNK1/2/3、p38以及PI3K的磷酸化水平顯著下降。

并且,MAPK通路激活劑ANI可以顯著下調由抑制KRAS引起的甘油三酯水平的上升,而740 Y-P對敲降KRAS引起的甘油三酯水平變化則沒有下調作用,反而進一步加強了脂質蓄積。

綜上,本研究表明KRAS可以調控3T3-L1和C2C12細胞增殖、自噬和成脂分化。研究結果有助于從分子水平解析脂肪的形成和積累的過程及機制,從而為調控肉類營養和成分、提升肉質提供了理論依據。

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