在生物化學與細胞分析領域，非蛋白質巰基（Non-protein Sulfhydryl，NPSH）含量測定是評估細胞氧化還原狀態、藥物毒性以及疾病診斷的關鍵技術環節。其操作規范性與準確性對于科研成果的可靠性以及臨床診斷的精準性具有決定性意義。

非蛋白質巰基基本概念與生物學意義

非蛋白質巰基主要指細胞內除蛋白質巰基之外的游離巰基，包括谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）等小分子巰基化合物。這些物質在維持細胞內氧化還原平衡、抵御氧化應激損傷、參與細胞信號轉導以及解毒過程中發揮著至關重要的作用。例如，在肝臟細胞中，GSH 占非蛋白質巰基總量的 85% - 90%，它通過與自由基反應，清除活性氧（ROS）與活性氮（RNS），保護細胞免受氧化損傷；在胰島 β 細胞中，Cys 作為胰島素合成過程中的重要巰基供體，其濃度變化直接影響胰島素二硫鍵正確形成與分泌，非蛋白質巰基濃度異常降低常與 2 型糖尿病胰島素抵抗及 β 細胞功能障礙密切相關。

非蛋白質巰基測定工作原理與方法選擇

巰基特異性顯色反應原理

非蛋白質巰基測定基于巰基與特定試劑發生氧化還原或絡合反應產生可定量檢測的顯色或熒光產物。常用試劑 5,5' - 二硫代雙 (2 - 硝基苯甲酸)（DTNB）與巰基定量反應生成 5 - 硝基 - 2 - 硫代苯甲酸（TNB - ），TNB - 在 412nm 處具有特征吸收峰，其吸光度值與樣本中非蛋白質巰基濃度呈正比關系。反應方程式為：DTNB + SH → TNB - + S - S，摩爾消光系數為 13600 L·mol?1·cm?1，檢測靈敏度可達 0.1 - 1μmol/L。此方法操作簡便、成本較低，適用于常規實驗室批量樣本檢測，但易受樣本中其他還原性物質（如維生素 C、尿酸等）干擾，需通過預處理去除干擾物質。

熒光標記與檢測原理

新型熒光探針（如 Monobromobimane，MB）與巰基反應生成強熒光產物（熒光激發波長 380 - 400nm，發射波長 460 - 490nm），熒光強度與非蛋白質巰基濃度在 0 - 10μmol/L 范圍內呈良好線性關系（線性相關系數 R2 ≥ 0.99）。熒光檢測方法具有高靈敏度、高特異性優點，可檢測低至納摩爾級別非蛋白質巰基濃度，特別適用于微量樣本（如單細胞、組織切片）分析，但儀器成本較高、操作相對復雜，對實驗環境要求嚴格（需避光操作，防止熒光淬滅）。

非蛋白質巰基測定操作步驟與要點

樣本采集與前處理

對于細胞樣本，收集對數生長期細胞，用預冷 PBS 洗滌 2 - 3 次，離心去除培養基與PBS，加入裂解液（含蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑，防止蛋白降解與去磷酸化干擾測定）按 106 個細胞 / mL 比例裂解，冰上孵育 15 - 30 分鐘，4℃ 12000rpm 離心 10 分鐘取上清，即為非蛋白質巰基提取液。動物組織樣本需精確稱取 0.1 - 0.2g 組織，用組織研磨器在液氮環境下研磨成細粉，加入 1mL 裂解液，冰浴超聲破碎（功率 200W，超聲 3 秒，間隔 5 秒，重復 10 次），4℃ 12000rpm 離心 15 分鐘取上清。血漿樣本直接離心（3000rpm，10 分鐘，4℃）取上清，所有樣本提取液分裝于EP管，-80℃保存，避免反復凍融。

測定步驟與條件控制

以 DTNB 法為例，取 100μL 樣本提取液于 96 孔板，加入 100μL 0.3mmol/L DTNB 溶液（用 0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.4 配制，現用現配），混勻后室溫避光反應 10 分鐘，用酶標儀在 412nm 波長測定吸光度值。每個樣本設置 3 個復孔，同時設置試劑空白對照（以樣本提取液替換 DTNB 溶液）。熒光法操作中，取 50μL 樣本提取液于 384 孔黑板，加入 50μL 50μmol/L MB 溶液（用 DMSO 配制，終濃度 25μmol/L），37℃避光反應 30 分鐘，用熒光酶標儀在 Ex/Em=380/460nm 測定熒光強度。兩種方法均需提前制作標準曲線，用 GSH 標準品（濃度范圍 0 - 50μmol/L）按相同步驟測定，繪制吸光度值或熒光強度與濃度的標準曲線，計算樣本非蛋白質巰基濃度。

非蛋白質巰基測定質量控制與結果分析

質量控制措施

每日檢測前需測定質控樣本（低、中、高三個濃度水平），其測定值應落入靶值 ±15% 范圍內。質控樣本可采用商業化的非蛋白質巰基定值血清或自制質控樣本（將已知濃度 GSH 溶液與正常血漿或細胞提取液混合制備）。每 20 個樣本檢測插入一個重復質控樣本，監控檢測過程穩定性。定期參加外部質量評價計劃（如英國生物學會 RSB 非蛋白質巰基檢測室間質評），確保實驗室檢測結果與國際標準一致。

結果分析與臨床意義解讀

非蛋白質巰基濃度在不同組織與細胞類型差異顯著，如肝臟細胞非蛋白質巰基含量高達 5 - 10mmol/kg 蛋白質，而紅細胞內濃度約為 1 - 2mmol/g 血紅蛋白。在氧化應激相關疾病（如肝病、腎病、心血管疾病、神經退行性疾?。┲?，非蛋白質巰基濃度普遍降低 30% - 70%，其下降程度與疾病嚴重程度呈正相關。例如，在急性肝炎患者血清中，非蛋白質巰基濃度可從正常值 0.8 - 1.2mmol/L 降至 0.3 - 0.5mmol/L，同時轉氨酶顯著升高；在 2 型糖尿病患者胰島細胞中，非蛋白質巰基減少導致胰島素合成障礙，空腹血糖與糖化血紅蛋白水平升高。動態監測非蛋白質巰基濃度變化可評估疾病進展與治療效果，如肝硬化患者經保肝治療后，非蛋白質巰基濃度逐漸回升，與肝功能指標（白蛋白、凝血酶原時間）改善同步發生。

非蛋白質巰基測定技術優化與常見問題解決

提高檢測靈敏度與特異性的方法

為降低樣本中維生素 C、尿酸等還原性物質干擾，可在樣本提取液中加入適量 N - 乙基順烏頭酸鹽（NEAA，終濃度 1mmol/L），此試劑可特異性抑制維生素 C 氧化還原酶活性，消除維生素 C 干擾。對于復雜生物樣本（如血漿、組織勻漿），采用固相萃取（SPE）技術預處理，用親水性 C18 柱吸附非蛋白質巰基，洗脫后測定，可提高檢測靈敏度 2 - 5 倍。優化反應條件，如將 DTNB 法反應溫度提高至 37℃，反應時間延長至 15 分鐘，可使檢測下限降至 0.05μmol/L；熒光法中，將反應 pH 調整至 7.8 - 8.0，MB 濃度優化為 30μmol/L，可增強熒光信號強度 30% - 40%。

儀器校準與維護要點

酶標儀需每月使用標準濾光片校準波長準確性（誤差＜±1nm），每季度檢查光路系統，確保光強穩定性（波動＜±2%）。熒光酶標儀除波長校準外，還需定期校準熒光強度（使用熒光標準品，如熒光素鈉溶液），校準頻率為每月一次。儀器使用完畢后，立即用蒸餾水沖洗比色皿或微孔板，防止殘留試劑結晶損壞儀器。對于長期不用的儀器，每月至少開機運行 30 分鐘，進行自檢與預熱，延長儀器使用壽命。